摘要
中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员周金秋团队历时6年多，成功删除了酿酒酵母全部300个剪接体内含子，构建了世界首个不含任何剪接体内含子的真核生物。研究发现，缺失内含子的酵母细胞仍能存活并繁殖，但生长速度减半，从109分钟延长至217分钟。细胞连续传代200代以上仍保持遗传稳定。该成果发表于《细胞》期刊，为研究内含子起源与进化提供了全新实验平台，并支持“基因组精简悖论”。团队通过巧妙的“分工重组”策略，将未来复现该过程的时间从至少12年缩短至不到4年。
没有内含子，真核生物能活吗？他们给出答案
2019年7月，中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员周金秋已经53岁了。他决定做一件至少需要12年才能完成的事——删除酿酒酵母基因组中的全部300个剪接体内含子，看看细胞还能不能活。
学生能否承受如此漫长的实验周期？自己退休前能否看到答案？考虑了一圈可能的后果，周金秋还是决定“背水一战”，把课题交给了暂时没有毕业压力的研究助理满鑫和张文婷。
6年后，世界首个不含任何剪接体内含子的真核生物在周金秋实验室“诞生”。团队又耗时一年多投稿、补实验、改稿，成果近日终于发表于《细胞》。
审稿人评价称：“利用单染色体酵母菌株实现了全部300个剪接体内含子的删除，是一个技术上意义深远的突破，完成了多个实验室长期未能完成的目标；所获得的菌株资源对未来研究具有重要价值，为此前无法开展的实验提供了全新平台。”
生存还是生活？真核生物基因表达存在类似视频剪辑的剪接过程。从一段基因序列到生成具备功能的蛋白质，中间有一个关键步骤——在剪接体作用下，内含子被删除，保留下来的外显子则按照顺序拼接起来。周金秋团队成果证明，追溯到进化起点，内含子并非真核生物存活的必要条件。不过，没有内含子的细胞活得没原来好。
团队主要关注剪接体内含子。这是真核生物中最常见的一类内含子，一般存在于编码基因中，需要由剪接体识别并切除。酿酒酵母中，此类内含子共有300个。
团队研究发现，在酿酒酵母中，随着剪接体内含子数量逐渐减少，对应菌株的生长速度逐步下降。300个内含子全部敲除后，菌株的倍增时间由109分钟延长至217分钟。尽管如此，菌株在连续传代200代以上后仍能保持遗传稳定，也保留了呼吸生长能力。此外，携带无剪接体内含子和正常染色体杂合的二倍体菌株，细胞的生长状态基本恢复，表明内含子缺失带来的影响具有隐性遗传特征。
根源在于核糖体生物合成受到了影响。核糖体参与mRNA翻译为蛋白的过程，而内含子丢失特异性影响了核糖体蛋白基因表达，使得整体蛋白质合成速率下降，最终影响细胞生长。某种程度上说，剪接体内含子扮演的角色，是让酵母细胞从维持基本生存转向生活得更好。周金秋推测，在真核生物进化过程中，出于某些原因，内含子被保留了下来，并逐渐参与细胞的生长调控。这一结果也支持“基因组精简悖论”，即内含子给细胞带来了负担，但删除它们又可能破坏在真核生物长期进化中被不断打磨的调控网络。
团队并未就此止步。在剪接体内含子全部敲除的酵母菌株中，细胞仍然会表达相关剪接体。团队进一步删除剪接体的多个核心组分后，细胞依然能够正常存活。他们判断，细胞保留一部分稳定但闲置的剪接体，或许是一种成本较低的策略，有助于维持对环境和遗传变化的适应能力。
经过多轮测序和实验验证，周金秋团队终于放下心来。从学术价值来看，这项研究为探索内含子的起源与演化提供了一个全新的实验平台，也为合成真核细胞最小基因组提供了重要参考依据。
将时间缩短到4年。回顾这段耗时6年多、几经起伏的工作，周金秋用“苦干加巧干”来形容。故事的起点要回到2018年。中科院分子植物科学卓越创新中心研究员覃重军团队与周金秋等合作，将酿酒酵母的16条染色体拼接在一起，形成只有一条线型染色体的酿酒酵母菌株SY14。2018年8月，论文发表于《自然》后，在国内外引发极大关注。但覃重军最初联系周金秋合作时，周金秋脱口而出的却是：“这不可能吧，技术上能实现吗？细胞能活吗？”直到测序结果摆在眼前，他才相信。
这项工作不仅给了周金秋很大鼓舞，也提供了关键实验条件。团队设计了一套“分工施工、重组拼装”的策略。具体而言，酿酒酵母有a型和α型两种交配型。团队在不同交配型的单倍体细胞中分别删除不同区段的剪接体内含子，随后让两种细胞交配形成二倍体，在指定位置诱导染色体交换，把删除内含子的序列整合到同一条染色体上。最后，通过减数分裂，团队再筛选携带目标染色体的单倍体子代。但在自然条件下，由于DNA核酸内切酶Spo11的存在，染色体会发生随机交换，而非定点交换。但倘若把SPO11敲除，子代的存活率则接近零。“酿酒酵母菌株SY14的二倍体细胞中只有两条染色体，可以避开不同染色体之间连错的情况。”满鑫回忆，团队删除SPO11基因后，菌株仍能完成减数分裂。在检测的44个四分体中，有23个产生了4个均能存活的子代。
接下来，团队又精心设计了“内含子清除路线图”。他们先用57个含有内含子的必需基因“试水”——倘若这些内含子均敲除后细胞无法存活，那就可以及时停止这个课题。他们按照染色体位置将这些基因分为3个区段，同步开始删除内含子。2022年7月，经过两轮“配对”和一次“精修”后，59个内含子被全部删除。细胞虽然生长有所减慢，但仍然能够繁殖。初现曙光！他们按照同样的方法，将剩余231个非必需基因中的241个内含子划分为10个染色体区段，开始了新一轮“删删删”。
到2024年2月，经过9轮定点染色体交换和9轮减数分裂，团队删除了296个内含子，并证实了细胞仍能存活。但在投稿过程中，他们却四处碰壁。一位“懂行”的审稿人提出了一个重要的问题，“有两个编码RNA的基因序列中内含子没有删除”。团队检查后，迅速补上了最后的缺口。最终，论文被《细胞》顺利接收。值得一提的是，有了团队建立的这套体系，未来复现敲除300个内含子的过程，所需时间将从原本至少12年变成不到4年。
“对于内含子数量更多、结构更复杂的多细胞真核生物，这些发现能在多大程度上推广，仍是一个开放且值得深入研究的问题。”周金秋补充道。
要放弃时再试一次。诚然，“巧干”压缩了时间，但“苦干”并没有减少。“这其实是一个比较‘无聊’的工作。满鑫和张文婷能够静下心来把这件事完成，很不容易。”周金秋说，“如果课题不顺利，轻则延毕一两年，重则几年白做，这对他们来说将是一个很大的打击。”而学生的反馈在一定程度上打消了他的顾虑。“这个工作很吸引我，我觉得它一方面很有挑战性，另一方面也很有意思。”满鑫道出接下这个课题的初衷。2019年硕士毕业后在周金秋团队做助理研究员、2021年读博，2026年博士毕业，满鑫几乎把所有时间和精力都放在了这个课题上，一心想着尽快把这件事做成。
在大部分时间里，她都做着近乎重复的事情——利用基因编辑技术把特定内含子删除，然后进行细胞培养、细胞增殖分裂再筛选，再反复。其中最难的是染色体交换，到了后期成功率只有不到5%。经过一轮染色体交换，往往只能在300~400个细胞中获得5个左右阳性细胞。至于细胞能不能减数分裂产生子代、产生的子代能不能活，还有待后续检验。“其实到最后我们差点放弃了，显微镜下放眼望去没有活着的细胞。”满鑫说，“周老师鼓励我们再试一下，他说前面已经花了四五年时间，只剩临门一脚了。”如今，满鑫已开启了事业的新主线。今年2月，她来到分子细胞卓越中心研究员陈玲玲团队做博士后研究，继续探索RNA和内含子缺失相关的内容。